### 培养条件

在对细胞进行培养时，建议使用95%的空气与5%的二氧化碳的气相环境，温度设定为37℃。推荐的培养基为DMEM，添加10%胎牛血清（FBS）及1%的青霉素/链霉素（P/S），采用贴壁细胞的方法。A-673细胞系来源于一名15岁女性的横纹肌肉瘤，能够在软琼脂中形成克隆，并在免疫抑制小鼠中显示出肿瘤形成的能力。

### 细胞传代方法

首次传代建议采用1:2的比例，传代周期一般为两天。在细胞传代时，应同时采购足够的培养基，确保细胞在良好状态下进行培养。收到细胞后，使用75%酒精对整个细胞瓶进行消毒，然后在超净工作台内操作，将细胞瓶放置于37℃、5% CO2培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态，再进行后续处理。在显微镜下观察细胞生长情况，并进行不同倍数的拍照记录（建议40x、100x、200x各一张）。前三天的照片将作为售后服务的重要依据，若未提供照片则默认细胞状态良好。

#### 细胞培养步骤

1. **细胞传代**：若细胞未超过80%的汇合度，将培养基收集至离心管中，留出5ml完全培养基，继续放入37℃、5% CO2的培养箱中。如果细胞密度超过80%，可以直接进行传代。

2. **贴壁细胞传代步骤**：
    1. 弃去培养上清，使用不含钙镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。
    2. 添加0.25%的胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞是否大部分变圆脱落。迅速返回操作台，通过轻敲培养瓶后加5ml以上完全培养基终止消化。
    3. 轻轻吹打使细胞完全脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000 RPM下离心5分钟，弃去上清，加入1-2ml完全培养基重悬。
    4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，放入37℃、5% CO2的培养箱中培养。

3. **悬浮细胞传代步骤**：
    1. 半换液法：竖着放置培养瓶在培养箱静置1小时，轻轻吸掉约3ml培养基，补充3ml完全培养基。若培养基变色缓慢，可以直接加入约500ul FBS。传代时可继续补充5ml培养基，分为两个培养瓶进行培养，一般经历3次后可进行离心传代去除死细胞。
    2. 离心换液法：如需分瓶，可以将细胞悬液收集到离心管中，1000 RPM离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml培养液后重悬，然后按1:2的比例分至新T25瓶中，添加6-8ml配制的新的完全培养基，以保持细胞生长活力，后续传代可按1:2~1:5比例进行。

### 细胞冻存及复苏

1. **细胞冻存**：细胞生长至覆盖培养瓶的80%时，弃去培养液，用PBS清洗细胞；
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，轻轻观测细胞状态。当细胞回缩变圆后，加入5ml完全培养基终止消化，再轻轻吹打以脱落细胞，转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，加入1ml的新葡萄8883官网AMG无血清冻存液，混匀后转移至冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱保存，若需要移至液氮罐，则在-80℃保存24小时后转入液氮罐。

5. **细胞复苏**：从液氮中取出冻存管（记得佩戴防护面具），迅速置于37℃水浴解冻，直至没有结晶，再用75%的酒精消毒冻存管外壁。
6. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
7. 弃去上清，重悬在5ml完全培养基中，接种至T25培养瓶中，并放置在37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养。
8. 第二天换新鲜完全培养基继续培养。

### 注意事项

某些细胞在运输过程中可能会发生脱落现象，这是正常的。如果脱落较多，可以将培养瓶里的所有培养液收集到离心管中，1000 RPM离心5分钟收集上清作过渡培养。然后加入胰酶1-2ml，轻轻吹打以重悬，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基终止反应，随后再离心、弃去上清，重悬在1-2ml培养基中，按1:2的比例分瓶传代（两个T25），补充新培养基至5-8ml/瓶，最后放置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。