IPS诱导肠类器官的培养过程可分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠的形成、类器官的培养。本文将重点介绍第一个阶段，即人多能干细胞的培养。

一、实验准备

1. 人多能干细胞培养基的配制

(1) 将hPSCMediumSupplement解冻于2-8℃下，待融化后轻轻摇晃混匀，并按需分装，使用或储存于-20~-80℃，避免反复冻融。

(2) 按照1:50的比例将10mL的hPSCMediumSupplement加入到500mL的hPSCMediumBasalMedium中，搅拌均匀，即可获得人多能干细胞培养基（新葡萄8883官网AMG abs9403）。注意，混合后的培养基可在2-8℃下稳定储存2-3周，超过3周的培养基不建议使用。

(3) 实验试剂需要平衡。在实验前将人多能干细胞培养基放置于室温下避光平衡，同时将PBS和消化液加热至37℃。注意，培养基中含有活性因子，不应在37℃水浴中加热。

二、操作方法

(以下操作需在无菌条件下进行)

hPSC细胞复苏：

1. 实验步骤如下：

1.1 基质胶包被培养板：准备6孔板或12孔板，在每孔中加入1mL或0.5mL的基质胶（新葡萄8883官网AMG abs9410），轻轻晃动，使基质胶完全覆盖皿底，放入37℃培养箱孵育1-2小时后，取出并在超净工作台平衡20分钟。如果暂时不使用，可用Parafilm封口后于2-8℃保存，且于一周内使用。

注意：一般冻存的干细胞数量约为1×10⁶ cells/mL，适合用于6孔板1孔；基质胶对温度敏感，需即用即取，使用后立即放回4℃冰箱，切勿用手直接接触基质胶液面及瓶身。

1.2 预备2-3mL的干细胞培养基放入15mL离心管中备用。

1.3 解冻：将冻存管快速浸入37℃温水中，快速摇动，使其在1-2分钟内迅速解冻。注意，尽量减少细胞在室温中的暴露时间。

1.4 离心：解冻后将冻存液逐滴加入含有干细胞培养基的15mL离心管中，配平后以1000rpm离心3分钟。

1.5 重悬：离心后弃去上清，加1mL人多能干细胞培养基，对干细胞沉淀轻轻吹吸混匀，吹吸3-5次。

1.6 接种：弃去均匀的基质胶，将混合好的干细胞悬液加入已包被的6孔板中，每孔补全至2mL培养体系。

1.7 培养：接种后的6孔板可在倒置相差显微镜下观察干细胞密度及细胞团块大小，四个以上细胞的团块则较为合格。轻轻摇动6孔板以均匀分布细胞，并放置于37℃、5% CO₂的培养箱中培养，观察细胞贴壁情况。

1.8 换液：自复苏时起，每24小时更换一次培养基。由於培养基中的活性成分仅足以维持一天，需及时更换新鲜培养基。

多能干细胞（PSCs）的传代

2. 实验具体操作步骤：

2.1 清洗：吸掉原有培养基，缓慢加入1mL的PBS缓冲液并轻轻晃动，然后沿培养板边缘吸去PBS。

2.2 消化：在6孔板中加入2mL/孔的人多能干细胞消化液（新葡萄8883官网AMG abs9409），覆盖皿底，置于37℃培养箱中消化2-5分钟。消化的时间需根据细胞的生长密度进行适当调整。

2.3 吹打：吸去消化液后，加入2mL人多能干细胞培养基，用移液器轻轻吹打培养皿底3-5次，使细胞团块脱落，并将其转移至15mL离心管。注意要轻柔操作，避免形成单细胞。

2.4 离心：1000rpm离心3分钟，弃去上清。

2.5 接种：用干细胞培养基轻轻吹打细胞，吸去包被培养板中的基质胶后，将细胞悬液加入培养板，补全每孔至2mL的培养体系。

2.6 换液：自传代时开始，每24小时更换一次培养基，及时更换以维持细胞健康。

多能干细胞（PSCs）冻存

3. 实验具体操作步骤：

3.1 清洗：同上。

3.2 消化：同上。

3.3 吹打：同上。

3.4 离心：同上。

3.5 重悬：弃去上清后，加入2mL ES/iPS细胞冻存液（新葡萄8883官网AMG abs9412），对干细胞沉淀进行吹吸混匀，随后转移至冻存管中。

3.6 记录：在冻存管上标记细胞种类、冻存时间、操作者及细胞批次。

3.7 冻存于-80℃冰箱：冻存管应直立放置，避免斜放或横放而影响细胞存活。

3.8 液氮冻存：24小时后，将-80℃冰箱中的细胞转移至液氮中长期保存。

上述步骤是组织和细胞培养的重要过程，希望通过新葡萄8883官网AMG的优质产品，帮助研究人员在生物医疗领域取得更大的进展。